Chromatographie CCM des pigments photosynthétiques d'une Elysie Hervé Kempf Lycée de l'Elorn

CHROMATOGRAPHIE CCM Nous utilisons en SVT la chromatographie sur couche mince ou CCM, pour séparer les différents pigments photosynthétiques d’un filtrat brut de pigments foliaires ou en écrasant dans un Eppendorf avec un peu de solvant, un morceau de feuille, des vers de Roscoff ou exceptionnellement une Elysie. La CCM comprend : une plaque de silice sur aluminium dont la mince couche blanche qui recouvre la plaque d’aluminium est formée d’un gel absorbant de silice qui sera la phase stationnaire et une phase liquide mobile l'éluant composée d’un solvant organique volatile comme l’éthanol qui va entraîner par capillarité dans la silice les pigments et les séparer le long de la phase stationnaire en fonction de leur solubilité. On se propose de voir en continu et en accéléré la chromatographie sur couche mince de silice d’une Elysie morte accidentellement dans notre aquarium. Ce gastéropode sacoglosse réalise une endosymbiose avec kleptoplastie et possède donc dans ces cellules intestinales des kleptoplastes capables de réaliser la photosynthèse. Les cellules intestinales de cette Elysie observées ici au MO x400 possèdent dans leur cytoplasme de nombreux chloroplastes verts dans lesquels se trouvent les pigments photosynthétiques. L’ultrastructure d’une cellules intestinales chlorophylliennes observée au MET x 10000 montre qu’elle a séquestré de très nombreux chloroplastes d’environ 3 µm qui s’ajoutent aux organites naturellement présents dans le cytoplasme d’une cellule animale. C’est dans les membranes photosynthétiques des thylakoïdes, réseau de sacs membranaires aplatis du stroma du chloroplaste et dans lesquels se déroule la phase photochimique de la photosynthèse que se trouvent les pigments photosynthétiques hydrophobes et liposolubles qui seront libérés dans un solvant organique puis extraits par CCM : les molécules de Chl a vert foncé, pigments essentiels de la photosynthèse et les pigments accessoires, Chl b vert-jaunâtre, xanthophylles jaunes et carotènes orange. Il faut broyer le tissu chlorophyllien dans le solvant organique pour dissoudre les membranes biologiques dont celles des thylakoïdes qui vont libérer les pigments photosynthétiques solubles dans le solvant et qui vont se retrouver dans la phase mobile de l’éluant. 1 - Préparer le solvant de l’éluant, le verser dans le fond de la cuve sur 5 mm de hauteur, fermer la cuve et laisser 5-10 min les vapeurs d’éluant très volatiles saturer le volume de la cuve. Ne pas respirer les vapeurs toxiques. 2 - Tracer à 1 cm du bas de la plaque un trait horizontal la ligne de base sur laquelle se feront les dépôts. 3 - Déposer avec un cône de micropipette, une petite quantité de solvant pigmenté. 4 - Laisser quelques secondes le solvant se vaporiser ce qui déposera les pigments dans la silice. Votre dépôt doit être le plus petit et le plus concentré possible. 5 - Recommencer un nouveau dépôt jusqu’à ce que la tâche soit la plus pigmentée possible. 6 - Placer délicatement la plaque de CCM dans la cuve qui contient l'éluant en veillant à ce que le dépôt de pigments ne plonge pas dans le solvant ce qui ferait sortir les pigments directement dans l’éluant. 7 - Laisser migrer les pigments pendant 15 à 20 min en suivant attentivement le front du solvant. La vitesse de migration dépend des solvants et de la T dans la cuve. 8 - Suivre la montée par capillarité du solvant le long de la plaque de CCM et par leur différente couleur, la séparation des différents pigments contenus dans le dépôt. 9 - Sortir la plaque de silice lorsque le front de l’éluant arrive à 1 cm du haut de la plaque. 9 - Marquer rapidement la ligne de front car le solvant très volatile va quitter la plaque. Le dépôt de l’éluant contenant les pigments est l’étape la plus délicate car il faut déposer une petite quantité de solvant et attendre quelques secondes qu’il se soit volatilisé avant de recommencer un nouveau dépôt et ainsi de suite jusqu’à ce que la tâche colorée soit la + foncée possible. La migration est rapide et montre dès le début que l’extrait contient 5 pigments différents qui vont se séparer en fonction de leur solubilité. Les plus rapides qui suivent de près le front de l’éluant sont les carotènes orange et les plus lents sont les xanthophylles jaunes. Une fois que la migration terminée, on remarque que la tâche formée lors du dépôt a disparue et que plusieurs tâches colorées sont apparues sur la plaque de silice correspondantes aux différents pigments photosynthétiques de l’Elysie : les pigments fondamentaux les molécules de chl a et les pigments accessoires chl b, phéophytines, xanthophylles et carotène. Dans l’ordre de la plus faible solubilité vers la plus forte solubilité dans l’éluant : les xanthophylles jaunes, les chl b, chl a, les phéophytines variété de chlorophylle dépourvue de magnésium et les carotènes les plus solubles juste avant le front de migration du solvant. H. Kempf, Enseignant SVT, lycée de l’Elorn le 03/12/2023.