میکروسکوپ فلورسانت
442 بار بازدید -
3 سال پیش
-
میکروسکوپ فلورسانس
یکی از مهم¬ترین
میکروسکوپ فلورسانس
یکی از مهم¬ترین میکروسکوپ¬های مورد استفاده در علوم بیولوژیکی میکروسکوپ فلورسانس است. این میکروسکوپ دارای ویژگی¬های منحصربه¬فردی است، که موجب تمایز آن از دیگر انواع میکروسکوپ¬ها میشود.
زهرا سروآزاد
میکروسکوپ فلورسانس منبع نوری با شدت بسیار بالا (نور فرابنفش) را به¬کار میگیرد که بخشهای فلورسنت را در نمونه مورد نظر، تحریک میکند. این بخشهای فلورسنت بازتابی با انرژی کمتر و طول موجی بلندتر از خود ساطع میکند که در این حالت تصویری با بزرگ¬نمایی مناسب از نمونه ایجاد میشود. این ویژگی به محققان توانایی مشاهده اندامکهای موردنظر یا ویژگیهای منحصربه¬فرد سطح نمونه مورد بررسی را میدهد.
به¬طورکلی از میکروسکوپهای فلورسانس برای موارد زیر استفاده میشود:
تصویربرداری از اجزای ساختاری نمونههای کوچک مانند سلول
انجام مطالعات زیست¬پذیری در مورد جمعیتهای سلولی
تصویربرداری از مواد ژنتیکی درون سلول DNA و RNA
مشاهده سلولهای خاص در یک جمعیت بزرگتر با تکنیکهایی مانند FISH
کار با میکروسکوپ فلورسانس
اغلب، در ابتدا نمونه مورد بررسی با ماده فلورسنت یا فلوئوروفور نشان¬دار میشود.
سپس از طریق عدسی با منبع نوری انرژی بالا، مورد تابش قرار میگیرد. این نور توسط فلوئوروفورها جذب شده و باعث میشود که آنها نور را با انرژی کمتر و طول موج بیشتر بازتاب کنند.
این نور فلورسنت با استفاده از فلیترهایی که برای طول موج خاص طراحی شدهاند، جدا میشوند و به بیننده اجازه میدهد تا تنها آنچه که دارای فلورسانس است را ببیند.
وظیفه اصلی میکروسکوپ فلورسانس این است که اجازه میدهد، پرتو نور بر نمونه مورد نظر بتابد و سپس نور بازتاب شده از نمونه با انرژی کمتر را جمعآوری کند. میکروسکوپ فیلتری دارد که فقط اجازه تابش پرتویی خاص با طول موج مشخصی که با ماده فلورسنت مورد استفاده، مطابقت دارد را میدهد. تابش این اشعه با اتمهای درون نمونه برخورد کرده و الکترونهای موجود در آن را برانگیخته میکند و به سطح انرژی بالاتر میبرد. زمانی که این الکترونها به حالت استراحت برمیگردند، به سطح پایینتری از انرژی میرسند و از خود نور ساطع میکنند. برای قابل تشخیص شدن این نور (قابل مشاهده برای چشم انسان)، فلورسانس ساطع شده از نمونه، از یک نور تحریکی روشنتر در فیلتر دوم جدا میشود. این کار به این دلیل انجام میشود که نور ساطع شده دارای طول موج بلندتر و انرژی کمتری نسبت به نور روشن کننده سطح است.
آماده¬سازی نمونه
نحوه¬ی آماده¬سازی نمونه برای مشاهده با میکروسکوپ فلورسانس برای نمونههای مختلف متفاوت است. مثلا:
تهیه نمونه با پروتئین¬های فلورسنت (پروتئین¬های فلورسنت سبز)
پروتئینهای فلورسنت سبز (GFPs) که از چتر دریایی«Aequorea Victoria» گرفته شده به¬عنوان یک برچسب فلورسنت، برای تصویربرداری از پروتئینها در سلولها استفاده میشوند. تنوع طیفی این پروتئینهای فلورسانس جهش¬یافته بدان معنی است که تصویربرداری همزمان چندین پروتئین در یک سلول قابل انجام است. از این پروتئینها برای سایر تکنیکهای تصویربرداری از سلولهای زنده نیز استفاده شده¬است. ژن پروتئینهای فلورسنت سبز درون DNA گنجانده شده که پروتئینهای مورد مطالعه را کد میکنند. از آنجا که رونویسی و ترجمه این ژنها هم توسط سیستم سلولی کنترل میشود، بنابراین هنگامی که ژن در آن ناحیه از DNA بیان شود؛ ژن پروتئینهای فلورسنت سبز همزمان بیان شده و پروتئینهای نشان¬داری تولید میشوند.
تهیه نمونه با پروتئینهای فلورسنت (آنزیمهای نشان¬دار)
روش دیگر نشاندار کردن پروتئینها از طریق آنزیمهای خود نشان¬دار، به نام نشانگرهای Halo یا نشانگرهای SNAP / CLIP است. آنزیمهای خود نشان¬دار میتوانند به صورت کووالانسی به یک لیگاند فلورسنت از قسمت باقی¬مانده اسیدآمینه¬ی آن بچسبند که اندازهای مشابه با پروتئینهای فلورسانس دارند. پروتئینهای بیان شده از این نوع در واقع فلورسنت نیستند و فقط زمانی که در معرض فلورسانس قرار میگیرند، پرتوهای فلورسانس از خود ساطع میکنند. در مقایسه با نشاندار کردن پروتئینهای فلورسانس، این روش از مزیت امکان نشان¬دار کردنهای پی¬درپی برخوردار است. از تکنیک آنزیمهای نشان¬دار برای بررسی فرآیند سلولی در طول زمان نیز استفاده میشود. استفاده از آنزیمهای نشان¬دار همچنین مکان ردیابی جمعیت پروتئینهای مختلف را طی یک دوره زمانی فراهم میکند.
نتیجه¬گیری:
امروزه بیشتر میکروسکوپهای فلورسانس مورد استفاده در زیست¬شناسی، میکروسکوپهای اپیفلورسانس هستند، به این معنی که هم تحریک و هم مشاهده فلورسانس در قسمت بالای نمونه اتفاق میافتد. بیشتر آنها از لامپ تخلیه قوس زنون یا مرکوری برای منبع نور قویتر استفاده میکنند
3 سال پیش
در تاریخ 1400/10/29 منتشر شده
است.
442
بـار بازدید شده